PowerSoil® DNA Isolation kit

強力土壤®DNA提取試劑盒

 

簡介

PowerSoil® DNA Isolation Kit包含了我們創(chuàng)新專利抑制因子去除技術(shù)®（IRT），用于提取所有類型環(huán)境樣品高質(zhì)量DNA。環(huán)境樣品包括堆肥、底泥、糞肥等富含腐植酸的各種難提土樣樣品。提取出來的高質(zhì)量DNA可直接進行PCR擴增。PCR擴增結(jié)果表明提取到了多種微生物，其中包括細菌（如枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌）、真菌（如酵母、霉菌）、藻類和放線菌（如鏈霉菌）。

 

珠磨研磨

PowerSoil® DNA Isolation Kit 不需要使用高速度強力珠磨研磨設備。若目的微生物需要比渦旋儀還要強力的均質(zhì)器才能提取得到，此試劑盒也可以用在PowerLyzer™ 珠磨研磨機上。MO BIO現(xiàn)在專門提供了PowerLyzer™ PowerSoil® DNA Isolation Kit（貨號：12855-50），一款使用了適合強力珠磨研磨的研磨珠套管的土壤DNA提取試劑盒。

 

相關(guān)產(chǎn)品	貨號	數(shù)量
PowerMax® Soil DNA Isolation Kit	12988-10	10 Preps
PowerSoil®-htp 96Well Soil DNA Isolation Kit	12955-4 12955-12	4×96 Preps 12×96 Preps
Ceramic Bead Tubes, 1.4 mm Glass Bead Tubes, 0.5 mm Glass Bead Tubes, 0.1mm	13113-50 13116-50 13118-50	50 tubes 50 tubes 50 tubes
PowerVac™ Manifold	11991	1 manifold
PowerVac™ Mini System	11992	1 unit + 20 adapters
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters	11992-10 11992-20	10 adapters 20 adapters

 

設備要求：

微型離心機（10000g）

移液器（50μl~500μl）

Vortex-Genie®2 渦旋儀（MO BIO貨號#13111-V-220）

渦旋儀適配器（MO BIO貨號#13000-V1或13000-V1-24）

 

試劑盒組分

	貨號：12888-50	貨號：12888-100
組分	量	量
PowerBead Tubes (contain 750 μl solution)	50	100
PowerSoil®Solution C1	3.3ml	6.6ml
PowerSoil®Solution C2	14ml	28ml
PowerSoil®Solution C3	11ml	22ml
PowerSoil®Solution C4	72ml	144ml
PowerSoil®Solution C5	30ml	2×3ml
PowerSoil®Solution C6	6ml	12ml
PowerSoil®Spin Filters (units in 2 ml tubes)	50	100
PowerSoil 2 ml Collection Tubes	200	400

△實驗前請先逐一檢查試劑!

 

保存

組分室溫（15-30℃）保存。

 

操作步驟：

1、加入0.25g土壤樣品到一個PowerBead Tubes中

這一步發(fā)生了什么:加入樣品后，下一步就是研磨均質(zhì)以及細胞裂解。PowerBead Tube中含有的緩沖液可（a）有助散開土壤，（b）初步溶解腐植酸，(c)保護核酸免于降解。

2、輕輕渦旋混勻

這一步發(fā)生了什么:混勻分散開各組分。

3、檢測C1溶液。若出現(xiàn)沉淀，60℃水浴至全溶解

這一步發(fā)生了什么：C1溶液含有SDS以及其它用于細胞裂解的試劑。SDS作為去垢劑，能破壞細胞膜上的脂肪酸、脂質(zhì)。溫度過低時會產(chǎn)生沉淀。60℃孵育可重溶SDS，并可趁熱使用。

4、加入60μl C1溶液，上下顛倒數(shù)次混勻

5、把PowerBead Tubes固定在渦旋儀適配器上，最大轉(zhuǎn)速（3200rpm，若渦旋儀達不到此速度，可適當延長5~10min）渦旋連續(xù)振蕩10min（若使用24頭適配器同時處理12個樣品，渦旋時間延長5-10min）。

【注意：渦旋振蕩步驟對于研磨均質(zhì)和細胞理解至關(guān)重要。步驟1~4的化學試劑作用，這一步引入機械作用。外形不規(guī)則而鋒利的研磨珠隨機碰撞，充分打開細胞膜釋放細胞內(nèi)容物。】

這一步發(fā)生了什么：微生物細胞在化學（裂解緩沖液）和機械（渦旋振蕩）力共同作用下崩解。許多類型微生物細胞只有在這種化學加珠磨研磨作用力下才會裂解。使用渦旋儀適配器可提供相同的力矩和角度最大化研磨效果。避免使用膠帶固定，以免震動過程中松脫影響研磨效果。

6、室溫10000g離心30s

7、轉(zhuǎn)移上清至一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中

【注意：注意：大約可獲得400-500μl上清液。回收到的上清體積取決于土樣的吸水性且不影響處理效果。上清可能顏色較深并含有少量土樣，下面步驟可解決這兩個問題。】

8、加入250μl C2溶液到上清中，渦旋混勻5s。4℃孵育5min

這一步發(fā)生了什么：C2溶液是IRT（抑制因子去除技術(shù)）重要組成之一。含有組分可沉淀那些會影響DNA純度和下游實驗的非DNA的有機、無機物質(zhì)，如腐植酸、細胞碎片、蛋白質(zhì)等。

9、室溫10000g離心1min

10、避開沉淀小珠，轉(zhuǎn)移上清≤600μl到一個新的收集管中

這一步發(fā)生了什么：沉淀物含有細胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。為了更高的DNA得率和純度，盡量避免吸到沉淀物。

11、加入200μl C3到上清中，渦旋混勻。4℃孵育5min

這一步發(fā)生了什么:C3溶液是另一個IRT（抑制因子去除技術(shù)）重要組成。含有組分可進一步沉淀那些會影響DNA純度和下游實驗的非DNA的有機、無機物質(zhì)，如腐植酸、細胞碎片、蛋白質(zhì)等。

12、室溫10000g離心1min

13、避開沉淀小珠，轉(zhuǎn)移上清≤750μl到一個新的收集管中

這一步發(fā)生了什么:沉淀物含有細胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。為了更高的DNA得率和純度，盡量避免吸到沉淀物。

14、C4溶液使用前先搖勻。加入1200μl C4溶液到上清中，渦旋混勻5s

這一步發(fā)生了什么:C4是一個高濃度鹽溶液。此步為了調(diào)整DNA溶液的鹽濃度。DNA在高鹽環(huán)境下可牢牢地吸附在硅膠濾膜上，大部分其它非DNA的有機無機成分不會吸附。但仍然會少量殘留。

15、加載約675μl 上清到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。棄去濾液，繼續(xù)加載675μl上清，室溫10000g離心1min。重復直至過濾完所有上清。

【注意：每個樣品共需加載3次。】

這一步發(fā)生了什么：DNA在高鹽環(huán)境下選擇性地吸附到硅膠濾膜上。

16、加入500μl C5到Spin Filter中，室溫10000g離心30s

這一步發(fā)生了什么：C5是以酒精為主的沖洗緩沖液，可進一步去除濾膜上非DNA成分的鹽份、腐植酸等雜質(zhì)。

17、棄去上清

這一步發(fā)生了什么：濾液不含DNA.

18、室溫10000g離心1min

這一步發(fā)生了什么：進一步去除殘留C5溶液（酒精沖洗液）。為避免殘留的酒精成分影響PCR、酶切、膠回收等下游實驗，必須充分去除C5溶液（可吹干）。

19、小心轉(zhuǎn)移Spin filter到2ml Collection Tube（試劑盒提供）中，盡量避免C5溶液污染

【注意：注意：極力避免酒精沖洗液污染。】

20、加入100μl C6溶液到白色濾膜中心

【注意：注意：C6要加到濾膜中心，并保證整個薄膜能充分潤濕。可選：無菌DNA-Free PCR Grade water 貨號#17000-10也可適用于DNA洗脫。若擔心DNA降解，可使用無菌TE緩沖液代替C6進行洗脫。】

21、室溫10000g離心30s

22、棄去Spin Filter。此時收集管中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步純化

    建議DNA冷凍保存（-20℃~-80℃）。C6溶液不含EDTA。

 

若使用PowerVac™ Manifold抽吸代替離心

每個樣品使用一個Spin Filter離心管。保持Spin Filter安放在2ml Collection Tube中知道需要真空抽吸濾過。記號筆標記標注好Collection Tube頂部及Spin Filter。若Spin Filter在過濾過程中堵塞，仍可以改為常規(guī)離心繼續(xù)繼續(xù)提取DNA。

此操作說明書第四步需要外自備100%乙醇。

1、每一個樣品需要安裝一個鋁質(zhì)PowerVac™ Mini Spin Filter Adapter（MO BIO貨號：11992-10或11992-20）到manifold的魯爾接口上。輕輕用力安緊Spin Filter。關(guān)閉manifold其它所有不用的接口。

【注意：鋁質(zhì)PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters可重復使用。】

2、加載650μl樣品裂解物（接上文步驟14）到Spin Filter。

3、打開真空泵，打開使用的端口的閥門。打開閥門是扶穩(wěn)Spin Filter，保持直立。等待裂解物全部通過濾膜，再加650μl裂解物。繼續(xù)抽吸濾過。關(guān)閉閥門。

【注意：可關(guān)閉已抽濾的端口，以提高其它端口壓力，加快抽濾速度。】

4、加入800μl 100%乙醇到Spin Filter。扶穩(wěn)Spin Filter，打開閥門抽濾。抽濾完成后關(guān)閉閥門。

5、每個Spin Filter加入500μl C5溶液。打開閥門抽濾。當所有C5濾完后，繼續(xù)抽濾1 min，抽干濾膜。關(guān)閉所有端口。

6、關(guān)閉真空泵。打開一個未使用的端口釋放manifold的壓力。若20個端口都在使用，斷開真空泵連接。進入下一步操作前確保真空壓力已釋放。必須先關(guān)閉真空泵，防止濾液倒流。

7、拿下Spin Filter，放回到原來標記的相應2ml Collection Tube中。10000g離心1 min以充分干燥濾膜。

8、把Spin Filter轉(zhuǎn)移到一個新的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中，加入100μl C6到白色濾膜中心。可選：可適用無菌DNA-Free Water洗脫DNA（貨號：17000-10）。

9、室溫10000g離心30s。

10、棄去Spin Filter。此時濾液中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步處理。

 

疑點難點

加樣量：

此試劑盒的設計加樣量是0.25g。不同土樣類型加樣量請參照下表：

土樣類型	建議最大加樣量（g）
干沙土  Dry sandy soil	0.5
干粘土  Dry clay	0.25
濕粘土  Wet clay	0.25
陶土  Potting Soil	0.1
底泥  Sediment	0.25
壤土  Loam	0.25
泥炭土  Peat moss	0.1
肥沃農(nóng)田土壤  Rich farm soil	0.25
改良土 Amended soil	0.15
堆肥  Compost samples	0.1

* 5g以上土壤DNA大量提取，建議用PowerMax Soil（貨號：12988-10）

 

濕土：

若土樣含水量較高，可先行室溫10000g離心30s，盡量去除上清。然后轉(zhuǎn)入PowerBead Tube進入下一步處理。

 

最終DNA呈棕色：

我們從未遇到使用PowerSoil的最終DNA呈棕色。若遇到此情況，請與我們聯(lián)系。

 

可選裂解方法（真菌、孢子樣品DNA提取）：

·加入C1溶液后，渦旋3~4s混勻，70℃孵育5min。渦旋3~3s，70℃再孵育5min。渦旋3~4s。此可選步驟能增加DNA得率，但同時會降低DNA完整性。

·若細胞非常難裂解，可加入C1溶液后70℃孵育10min，然后進行第五步繼續(xù)操作。

 

附加應用與文獻

根尖/菌根（Root tips/Mycorrhizae）

微生物入侵植物根尖，以及菌根的現(xiàn)象在許多植物種類中比較普遍。為了更好地提取組織內(nèi)外分布的微生物，建議把研成粉末的組織加入到Bead Tube中進行處理。

相關(guān)文獻：

De Souza, F.A., G.A. Kowalchuk, P. Leeflang, J.A. van Veen, and E. Smit. 2004.  PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Profiling of Inter- and Intraspecies 18s rRNA Gene Sequence heterogeneity is an Accurate and Sensitive method to Assess Species Diversity of Arbuscular Mycorrhizal Fungi of the Genus Gigaspora. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3): 1413-1424.

 

微生物墊和生物薄膜（Microbial Mats and biofilms）

微生物墊與生物薄膜廣泛分布在自然環(huán)境中。生物墊或薄膜為棲息在其中的微生物群落提供保護，直接研磨均質(zhì)整個微生物墊和生物薄膜，處理效率非常低。建議使用PowerBiofilm™ DNA and RNA Kit.

 

真菌墊（Fungal Mats）

PowerSoil適合提取生長在培養(yǎng)基中的真菌DNA。處于生長旺期的真菌菌絲含有大量DNA，可采集這部分樣品進行提取。為了提高破壁效率，樣品加入到Bead tube后，可于-70℃或-20℃至完全凍結(jié)，然后立刻轉(zhuǎn)移到65℃水浴。重復一遍，然后加入C1，進入下游步驟。。

 

土壤孢子（細菌、真菌）

真菌孢子外壁含豐富的多糖，因此比細菌孢子更難裂解 。采用上文的反復凍融，以及70℃孵育15min，可提高細胞裂解效率。若只是從純培養(yǎng)中提取孢子，建議使用UltraClean  Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Catalog# 12224-50)。

 

糞便樣品以及牛糞肥

PowerSoil可以在不修改操作步驟的境況下提取絕大多數(shù)糞便樣品。

相關(guān)文獻：

1.  Clement, B.G., and C.L. Kitts. 2000.  Isolating PCR Quality DNA from Human Feces with a Soil DNA Kit. 

Biotechniques 28(4): 640-644.

2.  Ibekwe, A.M., P. Watt, C. Grieve, V. Sharma, and S. Lyons. 2002.  Multiplex Fluoregenic Real-Time PCR for Detectio

and Quantification of Escherichia coli O157:H7 in Dairy Wastewater Wetlands.  Appl. Environ. Microbiol. 68(10): 48534862.

3.  Ibekwe, A.M., C.M. Grieve, and S.R. Lyon. 2003.  Characterization of Microbial Communities and Composition in

Constructed Dairy Wetland Wastewater Effluent.  Appl. Environ. Microbiol. 69(9): 5060-5069.

4.  Trochimchuk, T., J. Fotheringham, E. Topp, H. Schraft, and K.T. Leung. 2003. A comparison of DNA extraction and

purification methods to detect Escherichia coli O157:H7 in cattle manure. J. Microbiol. Methods 54: 165-175.

 

瘤胃樣品：

相關(guān)文獻中詳細描述了用PowerSoil提取瘤胃樣品PCR級純度DNA的方法。瘤胃樣品中微生物非常活躍，不過同時也含有大量多糖多酚。這些雜質(zhì)會抑制下游分子生物學實驗。使用UltraClean Soil 或PowerSoil，加上文獻提供的操作優(yōu)化步驟，可提取到高質(zhì)量的DNA。

相關(guān)文獻：

Mackie, R.I.. R.I. Aminov, W. Hu, A.V. Klieve, D. Ouwerkerk, M.A. Sundest, and Y. Kamagata. 2003.  Ecology of Uncultivated Oscillospira Species in the Rumen of Cattle, Sheep and Reindeer as Assessed by Microscopy and Molecular Approaches. Appl. Environ. Microbiol. 69(11): 6808-6815.

 

昆蟲樣品：

此類樣品可用UltraClean® Tissue & Cells DNA Isolation Kit進行提取。

 

珊瑚礁（Coral Reef）

PowerSoil也同樣適合提取珊瑚樣品中共生的微生物PCR級純度基因組DNA。從珊瑚礁上取1.3cm直徑的珊瑚塊，10X TE緩沖液沖洗獲得微生物。把沉淀下來的微生物細胞連同緩沖液一起用PowerSoil或Ultraclean Soil提取DNA。下文獻有更多操作細節(jié) 。

相關(guān)文獻：

Rohwer, F., M. Breitbart, J. Jara, F. Azam, and N. Knowlton. 2001. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastraea franksi. Coral Reefs 20: 85-91.

 

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