RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit

強力土壤® 總RNA提取試劑盒

 

操作步驟更新：

l  （步驟3-5）酚氯仿（pH6.5-8.0，[用戶自備]）從原來5min渦旋震蕩后加入，改為渦旋振蕩前加入。

l  （步驟12）步驟12的孵育改為在室溫下進行。若原來-20℃溫度下孵育能獲得理想得率，你可維持原溫度孵育。

 

簡介

RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit專門設計用于提取土壤微生物總RNA。試劑盒性能優越，能始終如一地去除腐植酸、富哩酸等RT-PCR抑制因子獲得純凈的，可直接用于RT-PCR分析的高質量純凈RNA。通過RT-PCR擴增RNA，證明包括堆肥、底泥、糞肥等富含有機物的各種類型土壤，使用此試劑盒均能體現微生物結構完整性。使用LifeGuard™ Soil Preservation Solution能在采集用于RNA提取的土樣后，運輸保存過程中，保持細菌存活的同時使其與處休眠狀態。無論從什么地方采集土樣，抑制RNase 和DNase的活性可保證cDNA的全長合成，以及16s rRNA profiling。LifeGuard™可保持微生物群落結構，-20℃ 30天，4℃ 2星期，室溫 1星期。室溫下保持RNA完整性30天。我們不建議用RNALater或RNAProtect保護土壤核酸。

 

操作預覽

土壤微生物多樣性的動態性根據微生物群落族群及其新陳代謝狀態變化而變化。影響因素有土壤的成分、含水量、日光照射、可利用養分等環境條件。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit設計可提取土壤微生物及微動物總RNA，包括休眠、正常代謝及死亡的微生物。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit可以提供完整的土壤微生物群落結構圖及RNA成分表。

此試劑盒僅供研究用途，非診斷用。

 

相關產品	貨號	數量
RNA PowerSoil® DNA Elution Accessory Kit	12867-25	25 preps
LifeGuard™ Soil Preservation Solution	12868-100 12868-1000	100ml 1000ml
UltraClean Agarose, Molecular Biology Grade	15003-50 15003-100 15003-500 15003-1000	50g 100g 500g 1kg
UltraClean®PCR Clean-Up Kit	12500-50 12500-100 12500-250	50 preps 100 preps 250 preps

新產品！試用我們的LifeGuard™ Soil Preservation Solution(MO BIO 貨號：12868-100)

室溫下運輸或保存土樣樣品期間保護核酸穩定長達30天！

 

重要提示：此試劑盒需要用戶自備酚/氯仿/異戊醇溶液（25:24:1， pH6.5-8.0）可從Amresc，Incorporated或 VWRInternational公司購買（見"酚/氯仿/異戊醇供應商"名單），或用戶自制。

注意：苯酚及酚/氯仿/異戊醇容易被氧化呈現黃色或粉紅色，指示該溶液不再適合用于RNA提取。使用帶顏色的酚/氯仿/異戊醇可能會影響最終RNA的質量。使用前存放于干凈的容器中，旋緊蓋子并避光4℃保存，以延長保質期。

 

設備要求：

15ml管離心機（2500g）

微型離心機（13000g）

移液器（20μl~1000μl）

移液器（1ml & 10ml）

水浴加熱設備（45℃，可選）

Vortex-Genie®2 渦旋儀（MO BIO貨號#13111-V-220）

渦旋儀適配器（MO BIO貨號#13000-V1-15）

 

需要但不提供的試劑

苯酚：氯仿：異戊醇溶液

 

試劑盒組分

	貨號：12866-25
組分	量
Bead Tubes (with 1.5g beads)	25
Bead Solution	69ml
Solution SR1	7ml
Solution SR2	22ml
Solution SR3	42ml
Solution SR4	165ml
Solution SR5	110ml
Solution SR6	28ml
Solution SR7	3ml
RNA Capture Columns	25
15ml Collection Tubes	100
2.2ml Collection Tubes	25

△實驗前請先逐一檢查試劑!

 

購買現成酚氯仿溶液

廠家名稱	試劑名稱	貨號	體積（ml）
Amresco, Incorporated	Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol	0883-100	100
Amresco, Incorporated	Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol	0883-400	400
VWR International	Phenol: Chloroform premixed with Isoamyl Alcohol 25:24:1	100513-510	100
VWR International	Phenol: Chloroform Buffered Solution 25:24:1	IB05174	400

 

保存

組分室溫（15-30℃）保存。

 

操作步驟：

1、加入2g土壤樣品到一個Bead Tubes（試劑盒提供）中。注意：參考疑難點關于土樣加樣量問題。

2、加入2.5ml Bead Solution、0.25ml  SR1溶液、0.8ml SR2溶液到Bead Tubes，渦旋混勻。

這一步發生了什么：緩沖液Bead Solution可分離微生物細胞與土壤成分。SR1溶液含有SDS以及其它用于細胞裂解的試劑。SDS作為去垢劑，能破壞細胞膜上的脂肪酸、脂質。SR2溶液為沉淀溶液，可去除腐殖質、細胞碎片及蛋白質等非DNA的有機、無機成分。有機及無機成分的污染會影響到最終RNA的質量并抑制下游RNA實驗。渦旋振蕩是樣品均質化和細胞裂解的關鍵步驟。

注意：溫度過低時會產生沉淀。60℃水浴可重溶SDS，并可趁熱使用。

3、加入3.5ml 酚/氯仿/異戊醇溶液（pH6.5-8.0，[用戶自備]），渦旋混勻直至分離層消失。

這一步發生了什么：加入酚氯仿可獲得最佳裂解效率和得率。裂解的細胞組分留在了有機相，蛋白變性。

4、把Bead Tubes固定在渦旋儀適配器（貨號13000-V1-15）上，最大轉速（3200rpm）渦旋連續振蕩15min。

這一步發生了什么：微生物細胞在1-3步化學（裂解緩沖液）和機械（渦旋振蕩）力共同作用下崩解。使用MO BIO的適配器是均質化樣品、裂解細胞的最經濟方法。你也可以用膠帶把Tube管固定在渦旋儀3.5英寸橡膠平板上。不過需要注意的是，膠帶會在渦旋振蕩過程中會松脫，造成裂解效率下降，樣品間結果不統一或得率不高。

5、取下Bead Tube，室溫下2500g離心10min。

這一步發生了什么：離心使得相位分離，最終可見三個分離層。最下層含有蛋白、細胞碎片，中間層含有腐殖質及其他有機無機成分，最上層含有總核酸。注意：中間層的厚薄決定于樣品類型，富含有機質的樣品會形成更厚的中間層。

6、小心地把Bead Tube從離心機取下，轉移上分離層（避開中間層及底部分離層）到一個干凈的15ml收集管中（試劑盒提供）。中間層的厚薄視樣品類型而定。Bead Tube中余下的酚/氯仿/異戊醇溶液棄于專用廢液回收容器中。注意：富含無機物的土壤，中下分離層可能比較厚實，需要用槍頭刺入底部苯酚層。

這一步發生了什么：含有總核酸的上分離層被轉移到了一個新的Tube管中。留下細胞碎片、蛋白質和其它有機成分。注意轉移上分離層時避免吸到中間或底層溶液。

7、加入1.5ml SR3溶液到水相分離層，渦旋混勻。4℃孵育10分鐘。

這一步發生了什么：第二次使用沉淀劑進一步去除蛋白質、細胞碎片。

8、室溫2500g離心10min。避開沉淀小球，轉移上清到一個干凈的15ml 收集管中（試劑盒提供）。

這一步發生了什么：含有核酸的上層溶液轉移到了一個新的15ml 收集管中。剩下非核酸成分。

9、加入5ml SR4溶液到含有上清液的收集管中，上下顛倒數次或輕輕渦旋混勻。室溫孵育30min。

注意：原來的操作說明是-20℃孵育30min。若你的土壤類型在-20℃下孵育能獲得理想的得率，請按照原方法進行。

10、室溫2500g離心30min。

11、輕輕倒掉上清，把15ml收集管倒扣于一張吸水紙上，停留5分鐘。

注意：根據土壤類型，底部沉淀可能更大或更黑。

這一步發生了什么：SR4為100%異丙醇。核酸形成沉淀后，棄去異丙醇。

12、SR5使用前先搖勻。加入1ml SR5溶液到15ml 收集管中。充分重懸沉淀。（注意：根據土壤類型，沉淀物有可能難于重懸。可45℃水浴10min，再稍微渦旋。重復直至充分重懸沉淀物。

這一步發生了什么：SR5為專利的鹽溶液，可重懸步驟14沉淀下來的核酸。同時平衡RNA capture column濾膜，為步驟16的沖洗和步驟20的洗脫做準備。

13、每個RNA樣品制備一個RNA capture column（試劑盒提供）：

a. 取下RNA capture column（試劑盒提供）的帽子，把RNA capture column放入一個15ml 收集管中。Column懸掛于15ml 收集管中。

b. 加入2ml SR5溶液到RNA capture column中，讓其自然流下，收集在15ml 收集管中。（注意：下一步加樣前勿讓column風干。

14、把步驟15獲得的RNA提取物加到RNA capture column中，讓其自然留下，收集在15ml 收集管中。

15、再加入1ml SR5溶液 沖洗RNA capture column。讓其自然留下，收集在15ml 收集管中。

這一步發生了什么：加到RNA capture column中的核酸選擇性吸附到column濾膜上。再加1ml SR5為了沖洗未被吸附的雜質，準備RNA洗脫。

16、把RNA capture column轉移到一個新的15 ml 收集管中（試劑盒提供）。SR6使用前搖勻。加1ml SR6溶液到RNA capture column中洗脫RNA。讓SR6自然流下收集在15ml收集管中。

這一步發生了什么：SR6洗脫緩沖液為專利的鹽溶液，可選擇性地把RNA從column濾膜上洗脫下來，留下DNA、殘留的細胞碎片及抑制因子等。注意：一款新的試劑盒（貨號：12867-25）可把剩余的DNA洗脫下來。

17、把洗脫下來的RNA轉移到一個2.2ml收集管（試劑盒提供）中。加入1ml SR4溶液。至少上下顛倒一次混勻。-20℃孵育10min。

18、室溫13000g離心15min，沉淀RNA。

19、棄去上清，把2.2ml收集管倒扣在吸水紙上晾干10min。

這一步發生了什么：SR4為100%異丙醇。洗脫的RNA沉淀、離心、晾干，然后重懸濃縮。

20、使用100μl SR7溶液重懸RNA沉淀物。

這一步發生了什么：SR7為RNase/DNase-Free水，用于重懸沉淀的RNA。SR7不含EDTA。此時RNA可直接用于下游實驗。為了延長RNA的保存時間，可用10mM Tris pH8.0代替SR7重懸RNA。
（注意：對于大多數類型土樣，最終RNA中攜帶的DNA并不明顯。而有機物含量特別高的樣品有可能增加DNA的污染。對DNA污染比較敏感的情況下，可使用經過檢測的引物做PCR擴增。瓊脂凝膠顯示有DNA條帶的話，請參照疑難點中的DNase處理。）

 

LifeGurad™ Soil Preservation Solution操作說明

1、每克土樣加入2~2.5倍體積的LifeGurad™ Soil Preservation Solution。如1g土樣加入2~2.5ml LifeGuard™。若采樣時直接把土壤加入到RNA PowerSoil™的 15mlBead Tube，2g土樣分量加5ml LifeGuard™。

注意：若處理的是沉積物等水分含量較高的樣品，每克樣品請加入3倍體積的LifeGuard™。

2、渦旋或手動搖勻，使所有土樣完全潤濕。此時LifeGuard™溶液頁面應該高于土樣。

3、根據實際條件-20℃、4℃或室溫保存樣品。提取 RNA前2500g離心5min，移除LifeGuard™溶液。

4、若直接使用15ml Bead Tube收集樣品，離心去除LifeGuard™溶液后直接進入RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit說明書步驟二繼續。

 

使用LifeGuard™保存的各種類型不同生物量和水分含量土壤已經成功通過測試。沉積物水份含量較高會稀釋LifeGurad™，需要更大的體積比（3:1）。

生物量對在不同溫度條件下LifeGuard保存微生物群落結構的性能影響很大。對生物量未知或周圍環境溫度超過一般室溫（22-25℃）的情況下，應轉移到-20℃或4℃，或加大LifeGuard™使用比例（＞2.5ml LifeGuard/ g 土樣）。長時間運輸或保存土樣（超過30days），請于-20℃保存土樣。

 

疑點難點

土樣類型和加樣量

最終RNA的得率和純度取決于處理的土樣類型。RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit經過驗證適合處理各種類型不同物理、化學、生物特性的土樣。根據我們的經驗，對于大多數樣品最多加樣2g。高有機物含量的樣品，加樣1g能更好地平衡RNA得率與DNA污染。

沉積物可稍微多加樣，我們曾經最多加樣5g。提取過程中，步驟12 SR4使用量可增至與裂解物體積一致（注意計算SR4消耗量）。

有些土樣或沉積物鹽分含量較高，步驟13中可見明顯的的白色或黃色鹽沉淀。此沉淀會減少核酸提取得率。為了克服鹽沉淀，加入SR4后可室溫孵育30min，取代原來的-20℃孵育。其它操作步驟不變。

 

酚/氯仿/異戊醇液相分離

為了保證酚/氯仿/異戊醇與水相充分分離，步驟7要在室溫下2500g至少離心10min。離心后，中間層的厚薄視土樣有機物含量多寡而不同。轉移上清時必須避免吸取中間層及底層。若吸取到了中間層或底層，重新離心已轉移的水相層一遍，分離水相層。或往混有苯酚/中間層的水相中加入等體積（2ml）氯仿，上下顛倒數次或渦旋混勻，室溫2500g離心10min。轉移上層水相，棄去下層苯酚/氯仿層。

 

SR5重懸沉淀

高有機物含量的土樣獲得的RNA沉淀可能難于重懸。45℃水浴加熱RNA沉淀有助于重懸。用槍頭攪動沉淀或渦旋也能輔助重懸。進入步驟17加樣到column前必須充分重懸RNA沉淀。未能充分重懸RNA沉淀會減少RNA吸附，降低其自然下流的速度，導致RNA損失。

 

Column沖洗洗脫

RNA Capture Column中液體只能通過重力流下，不能使用離心機或真空泵抽吸。

 

使用RNase-Free DNase消化RNA

注意：只有RNase-Free DNase才使用于本操作說明。RNases的存在會消化掉RNA。

對于絕大多數類型土樣，RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit不存在DNA污染。但高有機物含量的土樣，仍有可能提取RNA的同時帶有DNA污染。請把下文操作說明與DNase生產廠家的說明書結合，處理RNA。

a. 若一次處理RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit得到的所有RNA，加入4單位的DNase，加入適當的DNase緩沖液和水，定容至200μl。通常10X DNase消化緩沖液為含10mM CaCl2、10mM MgCl2的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5。

b. 37℃孵育30-45min。

c. 計入200μl酚/氯仿/異丙醇（pH6.5-8.0），渦旋混勻。室溫孵育5min

d. 10000g離心5min。

e. 小心轉移上層液相到另一Tube管中。

f. 加入1/10體積的5M NaCl，2倍體積的100%乙醇，上下顛倒混勻。

g. -20℃孵育30min，10000g離心10min。

h. 棄去上清，晾干沉淀小球。

i. 使用與沉淀一樣體積的SR7重懸小球。此時RNA可不用稀釋直接用于RT-PCR等下游實驗。

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更多實用技巧請參閱http://www.yibuzhiyao3d.cn/MBweibo/blog.htm