UltraClean® DNA Isolation kit

土壤DNA提取試劑盒

 

簡介

MO BIO的UltraClean® Soil DNA Isolation Kit已經成為了眾多土壤微生物研究者的首選。可從土壤中國年提取高質量PCR級基因組DNA。

 

珠磨研磨

UltraClean® DNA Isolation Kit 不需要使用高速度強力珠磨研磨設備。若目的微生物需要比渦旋儀還要強力的均質器才能提取得到，此試劑盒也可以用在PowerLyzer™ 珠磨研磨機上。MO BIO現在專門提供了PowerLyzer™ PowerSoil® DNA Isolation Kit（貨號：12855-50），一款使用了適合強力珠磨研磨的研磨珠套管的土壤DNA提取試劑盒。

 

相關產品	貨號	數量
UltraClean® Mega Soil DNA Isolation Kit	12900-10	10 Preps
UltraClean®-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit	12896-4 12896-12	4×96 Preps 12×96 Preps
UltraClean® PCR Clean-Up Kit	12500-50 12500-100 12500-250	50 Preps 110 Preps 250 Preps
Vortex Adapter, holds 24 (1.5-2.0 ml) tubes	13000-V1-24	1 unit
Ceramic Bead Tubes, 1.4 mm Glass Bead Tubes, 0.5 mm Glass Bead Tubes, 0.1mm	13113-50 13116-50 13118-50	50 tubes 50 tubes 50 tubes
PowerVac™ Manifold	11991	1 manifold
PowerVac™ Mini System	11992	1 unit + 20 adapters
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters	11992-10 11992-20	10 adapters 20 adapters

 

設備要求：

微型離心機（10000g）

移液器（50μl~500μl）

Vortex-Genie®2 渦旋儀（MO BIO貨號#13111-V-220）

渦旋儀適配器（MO BIO貨號#13000-V1或13000-V1-24）

試劑盒組分

	貨號：12800-50	貨號：12800-100
組分	量	量
Bead Solution Tubes (contain 550  l solution)	50	100
Solution S1	3.3ml	6.6ml
Solution IRS	11ml	22ml
Solution S2	14ml	27.5ml
Solution S3	72ml	143ml
Solution S4	16.5ml	30ml
Solution S5	3ml	6ml
Spin Filters units in 2 ml tubes	50	100
2 ml Collection Tubes	15	300

△實驗前請先逐一檢查試劑!

 

保存

組分室溫（15-30℃）保存。

 

操作步驟：

1、  加0.25~1g土壤樣品到一個2ml bead solution tubes中。（要一次提取更大量土樣，可選擇UltraClean Mega Soil kit。關于加樣量，可參考下文疑難點。）

這一步發生了什么：土樣或糞便樣品加入到Bead Tube 中。這是裂解細胞的首要步驟。Bead Solution是一個緩沖液，可分散開土樣，并初步溶解腐植酸。

2、  輕輕渦旋混勻

這一步發生了什么：混勻樣品與Bead Solution。

3、  檢查S1。若出現沉淀，60℃水浴至全溶解。

這一步發生了什么：S1溶液含有SDS，溫度過低時會產生沉淀。60℃孵育可重溶SDS，并可趁熱使用】

4、  加入60μl S1，上下顛倒數次混勻

這一步發生了什么：S1容易含有SDS，作為去垢劑可破壞細胞膜結構。

5、  加入200μl IRS 溶液。（僅當最終DNA需要跑PCR是才需要添加，否則省略）

這一步發生了什么：IRT是專門設計用于去除腐植酸和其它PCR抑制因子的專利溶液。若最終DNA是用于PCR擴增，此步不能省略。腐植酸呈棕色。富含有機質的土壤通常含有大量腐植酸。

6、  把bead solution tubes安放到渦旋儀適配器中（貨號13000-V1或13000-V1-24），或使用膠帶固定在渦旋儀橡膠平板上。最大轉速(3200rpm，若渦旋儀達不到此速度，可適當延長5~10min)渦旋振蕩10min。（若使用24頭渦旋儀一次處理多于12個樣品，請把渦旋時間延長5-10min。）

這一步發生了什么：把Tube管牢靠地固定在渦旋儀上，對樣品之間的一致性和DNA得率至關重要。只有膠帶固定，容易在振蕩過程中松開，影響研磨效果。我們已經設計出了專門用在渦旋儀上的適配器，可以緊緊卡住Tube管。

這步主要是引入機械作用力。在機械和化學試劑共同作用下裂解細胞。研磨珠不規則鋒利外形與微生物細胞相互碰撞，破開細胞。

7、  室溫10000g離心30s

這一步發生了什么：沉淀物含有細胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。DNA在上清液中。

8、  轉移上清到一個2ml 干凈收集管中（視不同土壤類型，一般0.2g土樣可獲得400~450μl上清液，并可能混入少量土壤）

【注意：以加入0.25g土樣計算，大約可獲得400-450μl上清液，上清液中可能仍然帶有部分土質。上清量因土壤類型不同可能有差異。

9、  加入250μl S2溶液，渦旋混合5s。4℃孵育5min。

這一步發生了什么：S2含有蛋白沉淀溶液。蛋白雜質會影響DNA純度，并抑制下游DNA實驗。

10     室溫10000g離心1min

11     避開沉淀小球，轉移450μl上清到一個干凈的2ml收集管中

這一步發生了什么：沉淀物含有細胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。為了更高的DNA得率和純度，盡量避免吸到沉淀物

12     使用前搖勻S3溶液，加入900μl S3溶液到上清中，渦旋5s混勻

【注意：此時溶液可能很滿，小心拿放。S3溶液為DNA綁定鹽溶液。在高鹽環境下，DNA會吸附綁定在硅膠薄膜上。】

13     加載700μl上清到一個Spin Filter中，10000g離心1min

14     棄去濾液，繼續加載剩下的上清，10000g離心1min。注意，每個樣品一共需要加載兩次。

【注意：每次提取大概一共需要加載三次。DNA選擇性地地府在硅膠薄膜上。其它成分則通過薄膜。】

15     加入300μl S4溶液，10000g離心30s

這一步發生了什么：S4是以酒精為主的洗液，可清除可能殘留在薄膜上的高鹽、腐植酸等其它雜質。注意：腐植酸較高的情況下你可以重復沖洗一遍。試劑盒配備的S4溶液有10%冗余。你還可以單獨訂購S4（貨號：12800-100-4）。

16     棄去濾液

這一步發生了什么：濾液中只含有酒精洗液等廢液。

17     室溫10000g再次離心1min

這一步發生了什么：此步用于去除殘留的S4溶液（含酒精）（也可吹干）。酒精成分去除不干凈會影響電泳凝膠加樣等下游實驗，必須完全去除干凈。

18     小心把spin filter轉移到一個干凈的2ml收集管中，避免S4溶液污染

這一步發生了什么：注意不要沾到任何S4溶液。

19     加入50μl S5到白色濾膜中央，

這一步發生了什么：S5（無菌洗脫緩沖液）要加入到薄膜中間，并保證整個薄膜能充分潤濕。

20     10000g離心30s

這一步發生了什么：DNA隨著洗脫液一起離心下來。DNA只在高鹽環境下才吸附在硅膠濾膜上。S5溶液是pH8.0 10mM Tris緩沖液，不含鹽。

21     棄去spin filter。此時收集管中的DNA可直接用于下游實驗

    建議DNA冷凍保存（-20℃~-80℃）。S5溶液不含EDTA。

 

若使用PowerVac™ Manifold抽吸代替離心

每個樣品使用一個Spin Filter離心管。保持Spin Filter安放在2ml Collection Tube中知道需要真空抽吸濾過。記號筆標記標注好Collection Tube頂部及Spin Filter。若Spin Filter在過濾過程中堵塞，仍可以改為常規離心繼續繼續提取DNA。

此操作說明書第四步需要外自備100%乙醇。

1、每一個樣品需要安裝一個鋁質PowerVac™ Mini Spin Filter Adapter（MO BIO貨號：11992-10或11992-20）到manifold的魯爾接口上。輕輕用力安緊Spin Filter。關閉manifold其它所有不用的接口。

【注意：鋁質PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters可重復使用。】

2、加載650μl樣品裂解物（接上文步驟12）到Spin Filter。

3、打開真空泵，打開使用的端口的閥門。打開閥門是扶穩Spin Filter，保持直立。等待裂解物全部通過濾膜，再加650μl裂解物。繼續抽吸濾過。關閉閥門。

【注意：可關閉已抽濾的端口，以提高其它端口壓力，加快抽濾速度。】

4、加入800μl 100%乙醇到Spin Filter。扶穩Spin Filter，打開閥門抽濾。抽濾完成后關閉閥門。

5、每個Spin Filter加入300μl S4溶液。打開閥門抽濾。當所有S4濾完后，繼續抽濾1 min，抽干濾膜。關閉所有端口。

6、關閉真空泵。打開一個未使用的端口釋放manifold的壓力。若20個端口都在使用，斷開真空泵連接。進入下一步操作前確保真空壓力已釋放。必須先關閉真空泵，防止濾液倒流。

7、拿下Spin Filter，放回到原來標記的相應2ml Collection Tube中。13000g離心1 min以充分干燥濾膜。

8、把Spin Filter轉移到一個新的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中，加入50μl S5到白色濾膜中心。可選：可適用無菌DNA-Free Water洗脫DNA（貨號：17000-10）。

9、室溫10000g離心30s。

10、棄去Spin Filter。此時濾液中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步處理。

 

獲得最大得率可選操作：

接步驟10

11、避開沉淀小球，轉移所有上清到一個干凈的收集管中

12、S3溶液使用前先搖勻。加入1.3ml S3溶液到上清中，渦旋5s混勻。（溶液太滿容易溢出，輕拿放）

接步驟13

 

疑點難點

加樣量：

根據土壤類型，常規加樣0.25-1g。吸水較多的如陶土，加樣0.25g。水分較多的樣品，見"濕土"部分。

部分土壤類型建議加樣量：

土樣類型	加樣量（g）
底泥 Sediments	0.25
粘土 Clay	0.10
陶土 Potting Soil	0.10
園土 Garden Soil	0.250
砂土 Sandy Soil	0.250

 

濕土：

若土樣水分含量很高，可把bead Tube內容物轉移出去，土樣加入到tube管，10000g離心30s。移液器盡量去除多余水分。Bead tube內容物移回來，接著步驟2繼續。

 

可選裂解方法：

加入S1溶液后，渦旋3~4s混勻。加入IRS溶液，渦旋3~4s混勻，70℃孵育5min。再渦3~4s，70℃孵育5min。此可選步驟能增加DNA得率，但同時會降低DNA完整性。

最終DNA呈棕色

說明土壤中腐植酸含量很高。可重復15~18步S4溶液的沖洗過程。若最終DNA仍然顏色較深，嘗試三倍稀釋最終DNA，加入兩倍體積的S3溶液，重新過柱、沖洗、洗脫。

 

若細胞難裂解

若細胞難于裂解，可先行70℃水浴10min，然后加入S1溶液。接著步驟5繼續。

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