我們從之前的文章中已經知道了如何使用我們的離心柱型試劑盒快速簡便地從組織中提取RNA 。

但我們還是經常被問到組織樣品microRNA（miRNA）的提取。MicroRNAs是長度約為22個核苷酸的小分子RNA，通過結合到mRNA 3'端非編碼區，通常在蛋白翻譯水平上抑制基因表達。在基因表達調整上起重要作用。每個miRNA可以抑制上百個靶mRNAs（1），miRNAs的錯誤表達常與疾病相關。正因為它們對基因表達的重要調控作用，目前miRNA研究主要方向集中在癌癥治療上（2）。

miRNA提取并沒有那么復雜

miRNAs的小片段特性意味著需要調整試劑配方，增強硅膠離心柱對小片段的吸附綁定。目前的配是方針對信使RNA的，丟棄了tRNA和小片段RNAs，對檢測低拷貝數的轉錄本帶來相當難度。因為5s和tRNA占總RNA 20%之多，丟棄前者相當于富集了信使RNA， 幸運的是，捕捉小片段RNA并不難。硅膠吸附技術中，影響濾膜綁定效果的有兩個因素：胍酸鹽和乙醇濃度。通過修改綁定步驟中乙醇的濃度，我們可以吸附綁定大多數小片段RNA，而通常情況下它們會被沖洗掉。主要稍微簡單修改就能解決問題，何必多花錢另外買一個試劑盒呢？

提取步驟

以下是使用UltraClean Tissue & Cells RNA Isolation Kit同時回收mRNA和miRNA的操作步驟：

1、按照原說明書均質化樣品，沖洗裂解物。 2、加入1.5倍體積的100%乙醇到裂解物中。 3、接著步驟繼續。

非常簡單，若Solution TR1（裂解緩沖液）在開始加了300μl，100% 乙醇用450μl。若Solution TR1加了600μl，100% 乙醇加900μl。

正常情況下這步加入70%乙醇到裂解物中，乙醇的濃度使得mRNA和tRNA都被吸附綁定，小片段RNA（＜200堿基)將被沖洗掉。你要找轉錄本，這么做就可以了。但如果你要做的是降解了的RNA，希望捕捉所有小片段RNA或miRNA，增加乙醇濃度就行。

從FFPE組織提取RNA

在談到降解RNA的時候，我想到了另一個話題，那就是從福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品中提取RNA，FFPE樣品中的RNA大多是小片段的。如果你要用試劑盒來提，你要用高濃度的酒精來綁定RNA。

通過改動四個主要步驟，你也可以用UltraClean FFPE Tissue DNA Isolation Kit提取FFPE組織RNA。

首先是為了提RNA而選用的另一種消化用裂解緩沖液。這個新的裂解緩沖液可以在加熱消化組織、去除蛋白交聯的過程中保護RNA（無需去除石蠟）， 用于去蛋白交聯的水浴溫度調整為70℃，時間為30min（替代DNA的90℃ 1個小時）（3）。

乙醇與裂解物的體積比增加到2：1，以在鹽環境下把所有RNA都綁定在濾膜上。

最后，在洗脫前用on-spin Column DNase Kit去除離心柱濾膜上的基因組DNA。

FFPE DNA Kit的其它組分都是一樣的。

總結

有那么多適用于RNA的試劑盒，現在很難去對比操作步驟，哪個更合適。方法并沒有那么復雜，所以如果一個試劑盒就能解決問題，為什么要買兩個試劑盒來提一個RNA呢？化學試劑的成分都是一樣的，為什么為了miRNA，要付出比提總RNA更多的錢呢？

如果你在研究miRNA，嘗試中有任何問題，請隨時聯系我們。

參考文獻：

1. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P., Grimson, A., Schelter, J. M., Castle, J., Bartel, D. P., Linsley, P. S., and Johnson, J. M. (2005). Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433, 769-773.

2. Li, C; Feng, Y; Coukos, G; Zhang, L (2009). "Therapeutic microRNA strategies in human cancer". The AAPS journal 11 (4): 747–57

3. Norikazu Masuda, Tadashi Ohnishi, Shoko Kawamoto, Morito Monden, and Kousaku Okubo (Nov 1999). Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res., Nov 1999; 27: 4436 – 4443.